擴增片段長度多態(tài)性AFLP是一種基于PCR技術(shù)的DNA指紋圖譜分析方法，主要用于檢測基因組DNA的多態(tài)性差異。其核心步驟包括限制性酶切、接頭連接、選擇性擴增和電泳分析。

1、酶切與連接：

基因組DNA經(jīng)兩種限制性內(nèi)切酶通常為EcoRI和MseI消化后，產(chǎn)生不同長度的片段。酶切產(chǎn)物兩端連接特定接頭序列，為后續(xù)PCR擴增提供引物結(jié)合位點。

2、預擴增階段：

使用與接頭序列匹配但末端含1個選擇性堿基的引物進行首輪PCR擴增，顯著降低片段復雜度。該步驟可提高后續(xù)選擇性擴增的特異性。

3、選擇性擴增：

采用末端含2-3個選擇性堿基的引物進行第二輪PCR，僅擴增部分匹配片段。選擇性堿基數(shù)量決定擴增條帶數(shù)量，通常產(chǎn)生50-100條可檢測條帶。

4、電泳檢測：

擴增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，通過銀染或熒光標記顯示多態(tài)性條帶。不同個體因基因組差異會呈現(xiàn)獨特的條帶分布模式。

5、數(shù)據(jù)解析：

通過比對電泳圖譜中條帶的有無及遷移率差異，可計算遺傳相似性系數(shù)。該方法分辨率可達單個核苷酸差異，適用于群體遺傳學和品種鑒定研究。

該技術(shù)操作時需注意DNA提取質(zhì)量直接影響酶切效率，建議采用CTAB法或商業(yè)化試劑盒獲取高純度DNA。實驗環(huán)境需保持潔凈以避免外源DNA污染，所有耗材應(yīng)經(jīng)高壓滅菌處理。數(shù)據(jù)分析階段建議使用專業(yè)軟件如GeneMarker進行條帶判讀，設(shè)置內(nèi)參樣本確保不同批次結(jié)果可比性。對于臨床樣本檢測，需建立標準化操作流程并通過盲法驗證重復性。